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您一定没听说过非洲猪瘟和恩诺沙星之间的关系

发布时间:2019-03-14 09:29:11   来源:饲料技术汇   阅读:6363次

喹喏酮类药物对非洲猪瘟的体外抗病毒活性研究

摘要

非洲猪瘟是一种病毒性疾病,目前尚无有效的疫苗和治疗方法。通过对30种喹喏酮类药物对非洲猪瘟病毒(ASFV)感染的抗病毒作用体外筛选,发现从感染早期开始,暴露于其中6种喹喏酮类药物(恩诺沙星,格列沙星,巴洛沙星,妥舒沙星,加替沙星,加雷沙星)或他们的一些组合时,ASFV感染的Vero细胞的细胞病变效应严重降低。此外,经过药物7天的处理后,PCR检测不到ASFV基因组,而且细胞培养上清液无法感染新的细胞。脉冲式凝胶电泳(PFGE)分析显示,暴露于这些喹喏酮类药物的细胞中,基因组碎片无法识别,病毒DNA复制减少,早期感染观察到病毒蛋白合成模式发生改变。总体结果表明,细菌拓扑异构酶抑制剂(喹喏酮类药物)可能通过某种靶向作用ASFV-拓扑异构酶Ⅱ来干扰ASFV的复制循环,为抗病毒治疗打开了新的窗口。

1 引言

非洲猪瘟(ASF)是养猪业中最具威胁的疾病之一。它在大多数撒哈拉以南非洲国家流行,2007年经格鲁尼亚重新传入欧洲大陆。从那时起,它开始蔓延到周边国家,极大地改变了欧洲的非洲猪瘟形势。除了受邻近国家的影响外,欧盟面临着引入非洲猪瘟的严重危险。由于缺乏协调的控制计划,缺少生物安全措施,以及传统上使用泔水喂养,俄罗斯联邦及其邻近地区对ASF的控制一直受到阻碍。在这种情况下,东欧的ASF的情况会让ASF进入欧盟的风险不断增加,尤其是那些难以控制的路线,如野猪的活动、动物和动物产品、受污染的车辆或其他污染物的非法转运。尽管人们努力研发疫苗,但目前还没有突破,对该病的控制依赖于早期诊断和实施包括扑杀在内的严格生物安全措施,同时这些措施对受影响的国家造成了严重的经济和社会危害。非洲猪瘟其病原是非洲猪瘟病毒(ASFV),一种大型DNA病毒,是非洲猪瘟科的唯一成员。ASFV编码一种拓扑异构Ⅱ型酶,这是哺乳动物感染病毒的一个独特特征。系统发育学研究表明,ASFV-拓扑异构酶Ⅱ不与宿主细胞Ⅱ型拓扑异构酶发生分支,与细菌DNA促旋酶和拓扑异构酶Ⅳ具有约25%的整体同源性,这增加了使用抗菌拓扑异构酶抑制剂(如喹喏酮类)干扰ASFV复制的可能性。

喹喏酮类化合物通过捕获DNA上的DNA促旋酶和拓扑异构酶Ⅳ,促进药物-酶-DNA裂解复合物的形成,从而表现出强大的抗菌活性。药物-酶-DNA裂解复合物诱导DNA复制的破坏,并触发细胞死亡机制(如氧化应激和基因组破碎)。DNA促旋酶负责在复制叉前减轻扭转应力,拓扑异构酶Ⅳ则显示了对基因组拆开的有效能力。

最近的研究表明,氟喹诺酮分子结构的化学修饰导致了它们对RNA和DNA病毒新的“非经典”抗病毒特性。考虑到ASFV编码一种拓扑异构酶Ⅱ,我们旨在通过Ba71V分离物感染Vero细胞培养,分析这些抗生素对ASFV-DNA复制和病毒蛋白合成的潜在抑制活性。鉴于目前还没有针对ASF的疫苗和治疗方法,发现新的抗病毒药物并将其应用于疫情中心附近农场的猪只,从而在疫情周围建立一个安全圈,这对于控制感染的传播和给当局实施应对措施的时间可能非常有用。

2材料与方法

2.1 细胞培养和病毒传播

Vero E6细胞来自ECACC,保存在DMEM中,添加10%热灭活犊牛血清、2m ML谷氨酰胺和非必需氨基酸(均来自Gibco公司),细胞保存在37℃、5%二氧化碳浓度、>90%湿度的培养箱中培养。如前所述,ASFV-Ba71V分离物通过在Vero细胞上的菌斑试验进行繁殖和滴定。

2.2 病毒感染和药物治疗

采用DMEM培养基将亚融合Vero细胞在6孔板上培养至每cm2约5万个细胞,并以0.1倍(MOI=0.1)的倍数感染ASFV-Ba71V。病毒吸附1小时后,取出接种物,用DMEM洗涤细胞2次。感染4小时后,ASFV感染的Vero细胞从第一代至第四代暴露于30个喹喏酮类药物,分别是:萘啶酸,氟甲喹,环丙沙星,依诺沙星,氟罗沙星,洛美沙星,那氟沙星,氧氟沙星,诺氟沙星,巴洛沙星,格雷沙星,左氧氟沙星,帕珠沙星,司帕沙星,托氟沙星,贝西沙星,克林沙星,加雷沙星,吉米沙星,莫西沙星,加替沙星,西他沙星,达氟沙星,二氟沙星,恩诺沙星,马波沙星,奥比沙星,普多沙星,沙氟沙星和新生霉素,分别是以下浓度500、400、300、200、100、75、50、25、10、5和1 ug/ml。所有药物均购自Sigma公司和安徽五矿开发有限公司,以1 mg/ml (0.1 M PBS/NaOH)的原液配制。培养7天,每24小时更换含抗生素培养基。每天用药物原液稀释(10 mg/ml, 0.1 M PBS/NaOH稀释),制备工作溶液。除了感染细胞外,还包括使用暴露于最高浓度氢氧化钠稀释剂的感染细胞的作为对照。预防试验在ASFV感染前2小时添加抗生素,7天内每24小时补充一次。

2.3 PCR检测非洲猪瘟病毒(ASFV)DNA

使用通过本课题组前期所述的A238L编码区的引物,进行PCR扩增检测病毒DNA (Gilet al., 2003),病毒DNA从感染的Vero细胞中提取,该Vero细胞未经过氟喹诺酮类药物商业试剂盒治疗处理,提取步骤完成后,将1 ul DNA转移到含有2.5 ul Taq缓冲液(10×)、1 ul MgCl2 (25 uM)、0.5 ul dNTP’s (10 uM)、15.3 ul ddH2O、0.2 ul Taq、0.25 ul各引物(100 uM)、正向(5’- GGCCGTACTTCAAATGTGCT-3’)和反向(5’- CCAGTCCCAAGCAGTAAAGC -3’)的PCR 混合液中,共25 ul。PCR反应如下:94℃2分钟,95℃变性30秒,42℃退火30秒,72℃扩展1分钟,最后72℃扩展10分钟。以2%的溴化乙锭琼脂糖凝胶为载体,在紫外光下观察扩增产物(预测720bp)。7天后,用培养上清液感染新的Vero细胞培养,重复上述步骤。

2.4 脉冲式凝胶电泳(PFGE)

Ba71V分离物分别以MOI为0.1、1和5感染Vero细胞,并在感染16小时后收集,经胰蛋白酶处理之后,将4×105个细胞包埋在低熔点琼脂糖塞子中,并且在固定之后,将来自每个实验组的塞子转移到含有2ml裂解缓冲液(125 mM EDTA, pH 8.0,1.2% SDS和蛋白酶K)的试管中50℃24小时,然后在24小时内用Tris-EDTA缓冲液(10mM Tris-HCl, pH 7.6和50mM EDTA, pH 8.0)对塞子进行清洗,将总DNA包埋在塞子中,在1%琼脂糖凝胶、0.5 ×Tris-Borate-EDTA缓冲液(45 mM Tris-HCl, 45 mM 硼酸, 1mM EDTA)中凝胶电泳。分离在CHEF DR II设备上进行,120度场角,8-30 s开关时间,6 V/cm, 14 ℃ 24小时,缓冲温度是用冰浴进行维持,采用低量程DNA阶梯作为大小标记(PFG Marker)。电泳后,用溴化乙锭染色4小时,在紫外线透照器下拍照。

2.5蛋白提取与Western blot分析

药物处理后,细胞生长在30mm培养皿中,之后对照感染组细胞和ASFV(非洲猪瘟病毒)感染组细胞在改良的RIPA缓冲液中溶解。全细胞溶解物在病毒感染6小时和32小时后制备,首先进行SDS-page凝胶电泳,后转膜到0.2毫米孔径硝化纤维素膜上,blot膜首先用5%胎牛血清(加1%吐温)封闭1小时,之后blot膜在加有特异性抗体的PBST溶液中孵育1 h。之后blot膜用PBST溶液洗涤三次,每次10分钟,之后用辣根过氧化物酶结合的二抗孵育30分钟,之后转膜蛋白用增强化学发光检测系统检测,根据厂家说明书(LuminataTM Crescendo, Millipore公司产品)。

2.6免疫印迹抗体和免疫荧光抗体分析

兔单克隆抗体抗a-微管蛋白(11H10株)由Cell Signalling Technology, Boston, USA提供,非洲猪瘟抗血清由Benedita Cruz,LNIV, Lisbon惠赠。辣根过氧化物二抗由Jackson ImmunoResearch Lab提供。过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(ref.111-035-003)和过氧化物酶标记的山羊抗猪IgG(ref.114-035-003)由West Grove, USA提供。免疫荧光实验使用了德州红标记的兔抗猪抗体作为二抗。防荧光猝灭使用DAPI(Vector Laboratories提供)做为介质。为了防止荧光染料褪色,我们小心地处理了载玻片并保持在黑暗潮湿的房间期间抗体孵化项目。免疫荧光实验使用荧光显微镜(型号为Leica DM R HC model)进行分析。数据由Photoshop CS5 软件处理,照片由ImageJ open source 软件处理。

2.7细胞活性实验

MTS实验(一种测定细胞增殖的方法)用于测定氟喹诺酮类药物对细胞的毒性,1 x103细胞培养在96孔细胞版,之后细胞分别暴露在100μg/ml,50μg/ml, 25μg/ml药物浓度下,为了确定背景值,3个孔只加药物溶液作为对照,孔中无细胞培养。7天过后,细胞培养皿中弃掉90μl的培养液,加上90μl的新鲜培养液和10μl的MTS。细胞在37 °C继续培养2小时。之后细胞中加入终止液,15分钟后轻搅孵育,在吸光度490 nm下,使用微型板阅读器读取数据。细胞活力由测定的值减去背景平均值得到。

3结果

3.1加入特定氟喹诺酮类药物后,感染非洲猪瘟病毒的细胞病变减弱

Vero细胞感染非洲猪瘟病毒后,会发生细胞病变,死亡和凋亡(Knudsen et al., 1987)。我们在ASFV感染Vero细胞中通过细胞病变来评估30种氟喹诺酮类药物抗病毒的效果。小部分筛选的氟喹诺酮类(恩诺沙星,格列沙星,巴洛沙星,妥舒沙星,加替沙星,加雷沙星)发现具有抗病毒活性,在100μg/ml浓度下。图Fig. 1A, a显示asfv病毒感染4小时后,加入这些氟喹诺酮类,经过7天的培养,仅出现轻微或者无细胞病变CPE。图Fig. 1A, b显示无氟喹诺酮类药物处理,感染72小时后Vero细胞出现严重细胞病变。图Fig. 1A, c为未感染ASFV的细胞,无细胞病变,图Fig. 1A, d显示感染的细胞出现细胞崩解,细胞核断裂,而不是细胞病变。然而,大部分单层细胞维持着未经处理的典型成纤维细胞样形态,而未经药物处理的细胞在感染12小时以后出现清晰的细胞病变,细胞质/细胞核值减少。

图:A a.用100ug/ml恩诺沙星处理细胞,感染非洲猪瘟病毒7天后后,观察到轻微的细胞病变或无细胞病变, b.细胞感染非洲猪瘟病毒后,未用恩诺杀星处理,72小时后出现严重的细胞病变

c.细胞未感染非洲猪瘟病毒d.细胞感染非洲猪瘟病毒后,经恩诺沙星处理后,可以看到细胞形态凋亡,细胞核崩解。

B用免疫荧光对比药物处理的细胞a和非洲猪瘟病毒感染的细胞b ,可以看到非洲猪瘟病毒感染12小时后,细胞出现病变,细胞变圆,非洲猪瘟病毒染色衰减(红色),而用药物处理的细胞,未出现细胞病变。蓝色为细胞核的颜色。为了解释本图图例中的颜色参考,读者可参考 文章的Web版本。)

3.2暴露于氟喹诺酮类药物后破环了ASFV感染

为了研究氟喹诺酮类药物对非洲猪瘟病毒的抑制,我们用PCR的方法检测非洲猪瘟病毒DNA片段,A238L,大约720bp。在100ug/ml的药物浓度处理下,在感染早期(即感染4小时后),可以看到非洲猪瘟病毒片段A238L显著减少甚至检测不到。在多种筛选的氟喹诺酮类药物中,如图Fig. 2A, lanes 3–29,药物浓度越高(50, 75 到 100 ug/ml),A238L越难检测到,呈现剂量依赖。同时,图(Fig. 2A, lanes32–57可以看到两种氟喹诺酮类药物(25 + 25 ug/ml 和 50 + 50 ug/ml)或3种氟喹诺酮类药物(15 + 15 + 15 ug/ml 和 25 + 25 + 25 ug/ml)联合应用时,能够增强对非洲猪瘟病毒复制的抑制。图Fig. 2B, lanes 5, 11, 14, 17,23 and 26显示从经过7天的治疗后ASFV感染的Vero获得的上清液,重新对非洲猪瘟病毒核酸阴性细胞感染7天,通过细胞毒性CPE观察和PCR鉴定,新细胞没有感染。表1总结了一种或多种氟喹诺酮类药物对非洲猪瘟病毒复制的影响,通过PCR检测。

图2所示:(A)氟喹诺酮类药物可抑制A238L病毒基因扩增。在暴露于选定的单/双/三种抗生素组合时,A238L扩增产物在ASFV感染细胞中减少或缺失。6种氟喹诺酮类药物在100 mg/ml时无病毒DNA扩增( 5, 11, 14, 17, 23和26),随后在(25 + 25 mg/ml和50 + 50 mg/ml)和三种组合(15 + 15 + 15 mg/ml和25 + 25 + 25 mg/ml) 时(32-57),一些氟喹诺酮联合暴露可导致A238L病毒基因扩增信号降低(32-43)。以模拟感染的Vero细胞和未处理的ASFV感染细胞分别作为阴性对照(1,30)和阳性对照(2,31)。在高浓度抗生素作用下,氯氟沙星(7-9)、司帕沙星(19-21)和克林沙星(28-30)的抑制作用也降低了。凝胶图像左侧为A238L特异性基因大小。(B) 经过7天的无药期后,氟喹诺酮类药物对A238L基因扩增的抑制作用仍持续存在。氟喹诺酮治疗后经过7天的无药期A238L扩增的细胞培养均为阴性 (如5、11、14、17、23和26)。以模拟感染的Vero细胞和未处理的ASFV感染细胞分别作为阴性对照( 1,30)和阳性对照(2,31)。凝胶图像左侧为A238L特异性基因大小。

当vero感染细胞暴露于特定的氟喹诺酮混合物时(25 + 25mg/ml和50 + 50mg/ml和三种组合:15 + 15 + 15 mg/ml和25 + 25 + 25 mg/ml)(图2A, 32-57),发现对病毒DNA复制有显著影响。经过7天的治疗,从感染ASFV的Vero细胞中提取上清液,进行ASFV DNA PCR扩增呈阴性,并且无CPE效应、没有感染新的细胞。(图2B,5、11、14、17、23和26)。表1总结了通过单个和氟喹诺酮联合使用,可充分抑制ASFV复制。

3.3 氟喹诺酮类药物可抑制ASFV DNA的基因组碎片复制

氟喹诺酮类药物的杀菌机理是促进药物-拓扑异构酶-DNA裂解复合物的形成(Fa`bregaet al .,2009)。因此,我们的目标是验证这些裂解复合物在ASFV病毒DNA上的形成。正如预期的那样,随着ASFV MOI(0.1, 1, 5)的增加从受感染的Vero细胞中获得DNA塞子,表现为全长病毒基因组的扩增数目(线性带170kb),以及不完整的病毒基因组24 hpi(图3,4-6)。 从先前暴露于恩诺沙星的受感染细胞中获得的DNA探针显示,完整和不完整的病毒基因组明显减少。((图3)当最高浓度使用(100 mg/ml)更加显著(图3,第12-14道琼脂)。探针塞来自模拟感染细胞(0和24hpi)(图3,泳道1和2 )未显示病毒基因组含量。此外,探针从暴露于依托泊苷的ASFV感染细(MOI=5),一个,特异性宿主细胞拓扑异构酶Ⅱ型毒物(1 mM)未显示碎片基因组的增加物种,提示II型宿主拓扑异构酶不,切割asfv病毒基因组(图3,泳道3)。未检测ASFV细胞基因组碎片在暴露于a氟喹诺酮药物后(图3,第7栏 and 11),和11栏),证实了从MTS获得的细胞毒性试验结果。

采用Western blot技术比较分析暴露于氟喹诺酮类和没有暴露于氟喹诺酮类of viral protein synthesis between ASFV-infected Vero cellsASFV感染Vero细胞间病毒蛋白合成exposed and non-exposed to fluoroquinolones. Since early。结果显示从早期开始phase of infection (6 hpi), the viral protein expression in感染阶段(6hpi),氟喹诺酮暴露组的细胞病毒蛋白表达fluoroquinolone-exposed cells (Fig. 4A, lanes 3–14) was(图4a,3-14道)不同于阳性对照组(图4a,2道);in exposed-cells, a small viral protein with 17 kDa was在药物暴露的细胞中仅仅在两条道viral proteins (63 kDa and 20 kDa) were only detected仅检测到病毒蛋白(63kDa和20kDa)。一个17kDa的小病毒蛋白only clearly identified in the non-treated infected control.仅在未经处理的感染控制中明确识别。At late phase of viral infection (32 hpi), viral proteins病毒感染后期(32hpi),病毒蛋白heavier than 50 kDa were only detected in the positive大于50kDa仅在阳性细胞中检测到,control (Fig. 4B, lane 2) whereas infected treated cells still对照组(图4b,第2道),而受感染的治疗细胞仍然displayed high expression levels of 35 kDa viral protein显示了35kDa高表达水平病毒蛋白和and low levels of 17 kDa viral protein (Fig. 4B, lanes 3–低水平的17kDa病毒蛋白(图4b,3- 14)。

在7天的暴露期后,6种fluoroquinolones induced a cellular growth inhibition,氟喹诺酮类药物诱导细胞生长抑制,使用100 mg/ml浓度下进行MTS分析,MTS assay. The reduction observed ranged from 40% with测定结果显示恩诺沙星生长减少15%,巴洛沙星减少40%(图5)。所有两种或三种两种或氟喹诺酮的组合使用中,显示与单种使用相比,细胞毒性更低。


图5

4讨论

非洲猪瘟病毒科、绿藻病毒科、彩虹病毒科是已知的通过编码拓扑异构酶Ⅱ(DNA病毒复制中关键的酶)来感染真核细胞的病毒属。

此外,感染非洲猪瘟病毒的Vero细胞中在上述提到的单种抗生素100 ug/ml浓度作用7天后,PCR检测不到病毒ASFV的A238L基因。 当受感染的细胞暴露于氟喹诺酮联合治疗(两种药物50/50 ug/ml,三种药物25/25/25 ug/ml),观察到类似单一氟喹诺酮类作用的结果。此外,药物处理过的感染后细胞上清液和未感染的新细胞培养物一样,7天潜伏期后非洲猪瘟病毒DNA呈阴性, 无细胞病变效应。

这些试验结果支持上述观点:氟喹诺酮类药物对非洲猪瘟病毒体外的感染有抑制作用,尽管病毒出现完全抑制作用只在早期加入氟喹诺酮类的试验中观察到,这也暗示着病毒复制酶的活性峰值可能出现在感染的早期。

正如在细菌中的作用一样,氟喹诺酮类与DNA回旋酶和/或拓扑异构酶IV结合相互作用DNA复合物导致复制进程受阻,从而抑细菌DNA、RNA和蛋白质合成,导致快速细菌细胞死亡(Drlica和Malik,2003;Malik等人,2007年、2010年)。我们使用PFEG技术研究发现暴露于所选氟喹诺酮类药物的感染细胞中的完整和不完整的病毒基因组基因均明显降低。但没有观察到病毒破裂后DNA碎片。这些研究结果或许可以证明氟喹诺酮类药物通过不同的机制对非洲猪瘟病毒产生作用。像其他人研究者指出的那样,PFEG可以检测高达250kb的小DNA片段(Birren和Lai,1994年)。因为喹诺酮类治疗可以影响细菌染色体DNA片段(例如金黄色葡萄球菌中30 kbp或大肠杆菌中的100 kbp) ,这些药物对ASFV的影响似乎与病毒染色体分裂无关。因此,氟喹诺酮类应作为ASFV拓扑异构酶II可逆抑制剂,与细菌中描述的作用机制相反。可能氟喹诺酮类药物会对ASFV拓扑异构酶的链转移活性干扰从而影响其ATP酶活性,通过抑制 ATP水解的最后一步会阻断DNA复制。两种抑制机制在复制叉前产生的扭转\复制压力,虽然没有导致基因组断裂但导致病毒DNA以及病毒蛋白的减少 。

同样值得注意的是,与未处理的ASFV感染细胞相比。暴露于依托泊苷(一种特定宿主细胞拓扑异构酶II抑制剂)的ASFV感染的细胞中完整/不完整的ASFV基因片段未显示明显下降。这一结果有力地表明了宿主拓扑异构酶II不经常参与病毒基因组复制,提示这种宿主酶ASFV所用。

关于病毒蛋白合成,免疫印迹分析显示在感染的早期(6 hpi)和晚期(32 hpi)ASFV感染的Vero细胞,未处理和处理之间出现严重差异。在细菌和真核细胞中报道(Baldwin和Osheroff,2005;Drlica等人,2008;Malik等人,2010)病毒蛋白合成的延迟是因为ASFV基因组的拓扑复杂性,减少了新的病毒基因组数量,从而影响病毒/宿主转录过程,损害病毒蛋白质翻译(Baldwin和Osheroff,2005;Drlica等人,2008年;Malik等人,2010年)。

在缺乏抗ASF疫苗的情况下,早期诊断以及实施严格的生物安全措施,包括淘汰扑杀是消除其传播唯一的战略。抗病毒治疗在ASF的爆发周边地区的应用,可以在一定程度上控制疾病。该试验证明了识别和鉴定抗病毒药物分子这一努力是正确的。有可能代表未来ASF的替代控制方法 。

我们的研究结果表明,6种氟喹诺酮类药物具有很强的抗ASFV作用。因此,这些药物分子被认为是可能治疗ASFV感染的潜在工具,当然进一步的研究这些药物在体内效果是十分必要的。

5基金

这项研究通过项目PTDC/CVT/105630/2008和两个博士奖学金(SFRH/BD/72872/2010 and SFRH/BD/65532/2009).

2010和SFRH/BD/65532/2009)得到了‘Fundacao para a Cienciae Tecnologia’基金的支持。

6利益冲突

作者声明对当前手稿没有利益冲突 。

*文章来源:In vitro antiviral activity of fluoroquinolones against African swine fever virus;2013年发表在Veterinary Microbiology杂志,影响因子IF:3.127




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本文来源:饲料技术汇

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更新日期:2019-05-07
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